一般社団法人
日本細胞生物学会Japan Society for Cell Biology

蛍光タンパク質を用いたオルガネラの可視化

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author柏木　彩花、大場　雄介
所属北海道大学大学院　医学院・医学研究院　細胞生理学教室
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Home Pagecp.med.hokudai.ac.jp
Keywordorganelle、fluorescence imaging
Published2022-03-31Last Update2022-03-31
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概要・原理

オルガネラ局在タンパク質と蛍光タンパク質を融合させたコンストラクト（オルガネラマーカー）は、生細胞でもオルガネラの局在や構造を可視化できるため、オルガネラの経時的な変化を観察することが可能となる。
当研究室では細胞骨格やエンドソーム、ミトコンドリアなどの12種類のオルガネラ局在タンパク質および局在配列と、群青色（Sirius）から近赤外色（iRFP713）までの6種類の蛍光タンパク質について、すべての組み合わせで発現プラスミドを作製し、その発現を確認した。自由記入欄にあるプラスミドはAddgeneから入手可能である（https://www.addgene.org/Yusuke_Ohba/）。

装置・器具・試薬

  • ［使用機器］
    35 mm glass base dish
    CO2インキュベーター
    蛍光顕微鏡
    ［試薬］
    DMEM, high glucose (10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)
    PEI MAX
    OPTIMEM
    DMEM/F12, no phenol red

    Addgene ID Plasmid Addgene ID Plasmid Addgene ID Plasmid
    159096 pFX-mito-EGFP 174464 pFX-Sirius-Sec61β 175834 pFX-Venus-KRasCT
    174177 pFX-mito-MiCy 174465 pFX-SECFP-Sec61β 175835 pFX-mCherry-KRasCT
    174178 pFX-mito-mKate2 174466 pFX-EGFP-Sec61β 175836 pFX-iRFP-KRasCT
    174179 pFX-mito-eqFP650 174467 pFX-Venus-Sec61β 175837 pFX-H2B-Sirius
    174180 pAcGFP1-mito 174468 pFX-mCherry-Sec61β 175838 pFX-H2B-SECFP
    174181 pFX-mito-roGFP 174469 pFX-GalT-Sirius 175839 pFX-H2B-EGFP
    174182 pFX-mito-EYFP 174470 pFX-GalT-SECFP 175840 pFX-H2B-Venus
    174183 pFX-mito-at pHluorin 174471 pFX-GalT-EGFP 175841 pFX-H2B-mCherry
    174184 pFX-Tom20-Sirius 174472 pFX-GalT-Venus 175842 pFX-H2B-iRFP
    174185 pFX-Tom20-SECFP 174473 pFX-GalT-mCherry    
    174186 pFX-Tom20-EGFP 174474 pFX-GalT-iRFP    
    174187 pFX-Tom20-Venus 174475 pFX-Lifeact-Sirius    
    174188 pFX-Tom20-ｍCherry 174476 pFX-Lifeact-SECFP    
    174451 pFX-EGFP-EEA1 174477 pFX-Lifeact-EGFP    
    174452 pFX-mCherry-EEA1 174478 pFX-Lifeact-Venus    
    174453 pFX-iRFP-EEA1 175822 pFX-Lifeact-mCherry    
    174454 pFX-EGFP-Rab5 175823 pFX-Lifeact-iRFP    
    174455 pFX-mCherry-Rab5 175825 pFX-β-tubulin-Sirius    
    174456 pFX-iRFP-Rab5 175826 pFX-β-tubulin-SECFP    
    174457 pFX-EGFP-Rab7 175827 pFX-β-tubulin-EGFP    
    174458 pFX-mCherry-Rab7 175828 pFX-β-tubulin-Venus    
    174459 pFX-iRFP-Rab7 175829 pFX-β-tubulin-mCherry    
    174460 pFX-EGFP-Rab11 175830 pFX-β-tubulin-iRFP    
    174461 pFX-mCherry-Rab11 175831 pFX-Sirius-KRasCT    
    174462 pFX-iRFP-Rab11 175832 pFX-SECFP-KRasCT    
    174463 pFX-mKate2-Rab11 175833 pFX-EGFP-KRasCT    

詳細　　＊それぞれの写真をクリックすると拡大します。

    • 35 mm ガラスベースディッシュをtype I-C コラーゲンでコートする。
    • Cos-1細胞をまき、37℃ 5% CO2環境下に置く。
      ※培養条件や細胞密度は細胞種に応じて変更する。
    • 翌日、オルガネラマーカー 1 µgをPEI MAXを用いてトランスフェクションし、37℃ 5% CO2環境下に置く。
      ※トランスフェクション試薬は細胞種に応じて変更する。
    • トランスフェクションから約6時間後、培地を交換する。
      ※培地交換の要不要は各試薬のプロトコルに従う。
    • 翌日から翌々日、培地をphenol red freeの培地に交換し、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察する【図１: 観察例】。

工夫とコツ

  • オルガネラマーカーは、オルガネラ局在タンパク質と蛍光タンパク質の組み合わせによって、目的のオルガネラ以外にも局在したり、オルガネラの構造を変えてしまうことがある。当研究室から提供しているプラスミドに関しては、Cos-1細胞およびHeLa細胞で局在を観察し、いくつかの組み合わせではmislocalizationが起こりやすいことを確かめている。こういった場合には組み合わせを変える他にも、原因となる塩基を特定して変異を入れるアプローチも有用である。例えばミトコンドリアマーカーについては、蛍光タンパク質のフォールディング効率を下げることでmislocalizationを抑えられる【参考文献】。
    オルガネラマーカーの中には発現量が高くなるほどmislocalizationが起こりやすくなるものもあるため、初めて用いるマーカーについてはトランスフェクション量の検討を推奨する。
    参考文献において近赤外色蛍光タンパク質として用いたiRFP713は、オルガネラ局在タンパク質との組み合わせによって、細胞内に針状の構造を形成することがある【図2: iRFP-Rab5】。

参考文献

  • S. Kashiwagi, Y. Fujioka, A.O. Satoh, A. Yoshida, M. Fujioka, P. Nepal, A. Tsuzuki, O. Aoki, S. Paudel, H. Sasajima and Y. Ohba. 2019. Folding Latency of Fluorescent Proteins Affects the Mitochondrial Localization of Fusion Proteins. Cell. Struct. Funct., 44: 183-194.

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