一般社団法人
日本細胞生物学会Japan Society for Cell Biology

Monitoring tfLC3

author田端 桂介
所属大阪大学大学院医学系研究科遺伝学教室
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Home Pagewww.fbs.osaka-u.ac.jp/labs/yoshimori/jp/
Keywordtandem fluorescent-tagged LC3 (tfLC3),
autophagosome-lysosome fusion,
autophagosomal maturation
Published2011-09-29Last Update2011-09-29
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概要・原理

細胞内のLC3ドットが増加していたからといって、オートファジーが亢進しているとは結論づけられない。なぜならばオートファジーによる分解が阻害されていてもLC3の蓄積につながるからだ。そこでオートファゴソームの成熟過程(オートファゴソームとリソソームの融合過程、あるいは融合したあとオートリソソーム内での分解)を調べる事で、オートファジーの亢進と区別する事ができる。このオートファゴソームの成熟過程を調べるのに有用なのが、mRFPとEGFPをLC3へタンデムに融合したtfLC3である。この融合タンパク質のEGFPのシグナルはリソソーム内の環境下において蛍光が減弱するのに対し、mRFPは同環境下でも安定である(図)。colocalized dots/mRFP dotsの割合を比べる事でオートファゴソームの成熟過程への影響を評価する。

装置・器具・試薬

詳細  *それぞれの写真をクリックすると拡大します。

    • tfLC3トランスフェクション前日、細胞を6 well plateに播種し、CO2細胞培養器内で18-24時間培養する。
    • 翌日、tfLC3のプラスミドを細胞へトランスフェクションし、CO2細胞培養器内で24時間培養する。
    • 【飢餓処理によるオートファジー誘導】培養液を除去し、PBSで細胞を2回洗い、飢餓(アミノ酸、血清飢餓)培地であるEBSSを添加する。富栄養条件は通常のgrwoth mediumを加える。
    • 用いる細胞に応じて1-4時間培養する。(例:MEFの場合1時間、A549細胞の場合4時間)
    • 【固定】 培養液を除去し、細胞をPBSで1回洗った後、固定のために4% PFAを加え室温で15分静置する。
    • 【Quenching】 PFAを除去し、細胞をPBSで2回洗った後、50 mM NH4Cl/PBSを添加し、室温で10分間静置する。
    • 【Mounting】 カバーガラスをPBSで3回洗浄した後、5 μlの退色防止剤を滴下したスライドガラス上にカバーガラスをのせ、余分な液をろ紙等で除去する。その後、爪に塗るマニュキュアを用いて、カバーガラスを固定する。
    • 【保存】 遮光して4℃保存
    • 顕微鏡を用いて観察

工夫とコツ

参考文献