一般社団法人
日本細胞生物学会Japan Society for Cell Biology

透過型電子顕微鏡サンプル作製

author國井 政孝
所属大阪大学医学系研究科細胞生物学教室
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Home Pagewww.med.osaka-u.ac.jp/pub/acb/
Keywordエポキシ樹脂, 四酸化オスミウム, 酢酸ウラニル
Published2011-09-05Last Update2011-09-05
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概要・原理

1/2 Karnovsky固定液にて灌流固定を行った組織を四酸化オスミウム、酢酸ウラニルで後固定ならびに電子染色を行い、脱水してエポキシ樹脂に包埋、重合させる。

装置・器具・試薬

詳細  *それぞれの写真をクリックすると拡大します。

    • 1/2 Karnovsky(2.5% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde, 0.1M cacodylate buffer)を用いて固定した組織片を24穴プレート(または下記4のバイアル瓶でもよい)に入れ、10% sucrose / 0.1M cacodylate bufferで洗う。氷上、5分。【fig.1】
    • 1% osmic acid / 0.1M cacodylate bufferで組織を後固定する。氷上、1時間。【fig.2】 *1時間以上は決しておかないこと(蛋白を破壊するため)
    • DDWで3回洗浄した後、0.5% uranil acetateに浸ける。2時間~オーバーナイト。 その日に脱水まで行いたい場合は1% uranil acetateで1時間でもよい。
    • ethanolを用いて脱水する。65%から99%まで室温で各5分程度。無水は20分を3回。その後、組織を24穴プレートからガラスのバイアル瓶に移し(propylene oxideによってプラスチックが溶けるため)、propylene oxideに浸ける。室温、20分2回。
    • アルミカップにEponとpropylene oxideの等量混合液を入れ、その中に試料を浸ける。デシケーターに入れて一晩以上液量が半分くらいになるまで静置する(長くても3日位まで)。【fig.3,4】
    • 新しいアルミカップにEponを入れ、混合液から試料を移す。デシケーターをポンプにつなぎ、4時間ほど脱気する。その後、新しいEponに移し、一晩脱気する。【fig.5】 *必ずしも新しいEponにする必要はないが、propylene oxideが残ると重合が不十分になってしまうため、安全のため1度新しいのに入れ替えるようにしている。
    • アルミカップを65℃のインキュベータへ入れ、Eponを重合させる。36時間以上。
    • 重合した後は糸のこぎりなどを用いて組織を切り出し、ボンドでビームカプセルに貼り付ける。【fig.6】 *ビームカプセルはシリコンカプセルにeponを流し込み、重合させて作成する。

工夫とコツ

参考文献