一般社団法人
日本細胞生物学会Japan Society for Cell Biology

マウスの灌流固定法

author國井 政孝
所属大阪大学医学系研究科細胞生物学教室
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Home Pagewww.med.osaka-u.ac.jp/pub/acb/
Keyword灌流固定, PFA, Karnovsky
Published2011-09-02Last Update2011-09-02
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概要・原理

組織固定はパラホルムアルデヒドやグルタールアルデヒドによって組織中の分解酵素を失活させ、それ以上の変性を防ぐと同時にペプチド鎖の架橋結合によって形態を維持し、細胞・組織を自然の状態に近いまま安定化することを目的とする。

装置・器具・試薬

詳細  *それぞれの写真をクリックすると拡大します。

    • ビーカーに入れたリンゲル液と固定液をお湯で40℃くらいに温めておく(マウスの体温が40度位のため、それに合わせる)。
    • マウスに麻酔液を腹腔内投与(体重の1/100量)し、痛み刺激に反応しなくなったら、解剖台に仰向けに固定する。【fig.3,4】
    • 開腹後、横隔膜を切開し、左右の肋骨を頭部方向へ切開する。
    • 剣状突起をつまんで頭部方向へ反転し、針で止め、心臓を露出させる。【fig.5】
    • 左心室にヘパリンを0.05-0.1 ml注入し、ノエス剪刀で右心耳を切る。【fig.6】 *この段階が一番大事。そのためには、ファイバー光源できちんと右心耳に光を当てて見やすくし、きちんと右心耳を見つけて、ちゃんと割を入れられるようにする(あまり割が小さいと還流液が体内にとどまって流れず、固定が不十分になってしまう)。また他のところ(右心室など)を切らないようにする。
    • チューブにつけた注射針を左心室に刺し、流量6~7でリンゲルを流す。針の先端に書いたマジック線の1本は外から見える深さに挿入する。【fig.7】
    • いったんポンプを止め(チューブに泡が入らないようにする)、チューブの先をリンゲルから固定液に入れ替える。流量6~7で固定液を流す。
    • 各組織を摘出し、固定液に浸けて後固定する。

工夫とコツ

参考文献