一般社団法人
日本細胞生物学会Japan Society for Cell Biology

観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法 (VIPアッセイ:Visible immunoprecipitation assay)

author加藤 洋平、野崎 梢平、中山 和久
所属京都大学薬学研究科生体情報制御学分野
連絡先このプロトコルへのお問合せ
Home Pagewww.pharm.kyoto-u.ac.jp/physchem/
Keyword免疫沈降法、蛍光タンパク質、GFP-Nanobody
Published2015-06-23Last Update2015-06-23
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概要・原理

私たちは蛍光タンパク質とGFP-Nanobody(ラクダ科の単鎖抗体)を用いた共免疫沈降法に蛍光顕微鏡を組み合わせた、観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法(VIPアッセイ:Visible immunoprecipitation assay)を開発した【図1】(Ref.1)。VIPアッセイの原理は一般的な共免疫沈降法と同じであるが、手間のかかるウエスタンブロッティングをするのではなく、免疫沈降後のビーズに結合している蛍光タンパク質のシグナルを蛍光顕微鏡で直接検出することで、従来の免疫沈降法よりも簡単、迅速、安価にタンパク質間相互作用を調べることができる。ここではGFPとRFP融合タンパク質間の相互作用を調べるときの標準的なプロトコールを紹介する。

装置・器具・試薬

詳細  *それぞれの写真をクリックすると拡大します。

    • HEK293T細胞を6 well plateに8.0 x 105 / wellでまいて24 h培養する。
    • Polyethylenimine (PEI)を用いてトランスフェクションする。(スケールアップ/ダウンする場合は【表1, 2】を参照。) 4 µg DNA (2µg GFP plasmid + 2µg RFP plasmid)/250 µL DMEM (血清を含まないもの) 20 µg PEI/250 µL DMEM (血清を含まないもの) , incubate, RT, ~5 min DNA sol. + PEI sol. Incubate, RT, 20 min 500 µL/ wellで加える。
    • トランスフェクション24時間後にGFPとRFPの発現を蛍光顕微鏡でチェックし写真を撮っておく。
    • 6 well plateから培地をよく取り除き、Lysis bufferを250 µL/well 加える。
    • On ice ~5 min (細胞が自然と浮いてくるのでスクレーパーでかき取る必要はない。はがれていない細胞が残っているときはプレートを軽く揺すったり叩いたりすればはがれる。)
    • 細胞をピペッティングで懸濁しつつ、エッペンチューブに移す。Incubate, on ice, ~15 min
    • 遠心 13,200 rpm (16,100 g), 4℃, 15 min
      (この間に0.2 mL tube stripに5 μL(bed vol.)のGFP-Nanobody beadsを分注しておく。)
    • 200 μLの上清をGFP-Nanobody beads入りのPCR tube stripに加える。
    • ローテーションしながらビーズに結合させる。 4°C, 1 h
      (著者らの研究室ではローテーターに0.2 mL tube stripをビニールテープで貼り付けて回転させている。)
    • Wash x 3回: 0.2 mL tube stripを10-30 sec遠心し、上清をアスピレーターで吸引する。
      180μLのLysis Bufferを加え、タッピングして懸濁する。
    • 180μL の水またはPBSでビーズを懸濁して96 well plate に移す。
    • 蛍光顕微鏡(20x/0.75NAの対物レンズを使用している)でビーズのGFPとRFPの蛍光を観察し写真を撮る。(蛍光強度を比較するため、露光時間などの条件は固定して撮影する。)

工夫とコツ

参考文献