一般社団法人
日本細胞生物学会Japan Society for Cell Biology

MEFのlysosomal exocytosisのassay

author原田 彰宏
所属大阪大学医学系研究科細胞生物学教室
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Keywordlysosome、beta-Hexosaminidase、lamp1、ionomycin
Published2012-03-24Last Update2012-03-24
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概要・原理

カルシウム刺激によって細胞内のlysosomeが細胞膜に融合し、内容物を細胞培養液に放出する。Ionomycin刺激後、lysosome内の酵素であるN-acetyl-beta-D-glucosaminidase (beta-Hexosaminidase) の量を蛍光基質である4-methyl-umbellyferyl-N-acetyl-beta-D-glucosaminideを用いて測定する方法である。

装置・器具・試薬

詳細  *それぞれの写真をクリックすると拡大します。

    • 細胞を12well plateにConfluentに増やす*
    • 2回PBSでwash*
    • 0.5cc PBS (+1.2mM CaCl2)(negative control)か
      0.5cc 1uM ionomycin in PBS (+1.2mM CaCl2) 300ulを加える*
    • 2,5,10分後に上清を回収し、11000g 5min遠心して上清をアッセイに使用
    • その後total cell lysateとして
      残りの細胞を0.3ccの0.5%TritonX100 in PBS中で15分、37度incubateし、中身をチューブに回収して11000g 5min遠心し、その上清を使用
    • アッセイ
      4の上清の175ulに25ul of 4mM 4-methyl-umbellyferyl-N-acetyl-beta-D-glucosaminide in 20mM Na citrate-phosphate buffer, pH4.5を加える*
    • 15min, 37C インキュベート
    • 反応を 2M Na2CO3, 1.1M glycine 50ul を加えて停止する
    • 蛍光をspectrofluoremeterで測定(excitation 365nm/ emission 450nm)
      (我々はSH9000 spectrofluoremeter (Corona Electric Co.Inc., Ibaraki, Japan) を使用した)
    • 細胞中の全beta-NAGの測定
      Cell extractを10倍希釈し、175ulをenzyme reactionに使う
    • 写真を取りたければ、4の処理後3%PFA(in PBS)で固定してlamp1に対する抗体(1D4B)をかけて染色出来る(写真参照)。当たり前だが細胞膜表面のlamp1を見たいので可溶化はしない。

工夫とコツ

参考文献