一般社団法人
日本細胞生物学会Japan Society for Cell Biology

soft-agar colony formation assay

author疋田 智也
所属阪大微研細胞機能分野
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Home Pagecell-biology.biken.osaka-u.ac.jp/MekadaLabHP/Home.
Keywordがん化, 悪性化, 足場非依存的増殖
Published2011-10-12Last Update2011-10-12
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概要・原理

細胞ががん化するとき、一般的に非接着条件下で増殖するという足場非依存的増殖能を獲得することが知られている。この評価にはマウスにおける造腫瘍性実験で確認できるが、その前段階としてin vitroで評価するsoft-agar colony formation assayがよく用いられる。本アッセイ系では、単層培養法と2層培養法が用いられるがここでは、よく用いられている2層培養法について解説する。

装置・器具・試薬

  • 【バッファー】
  • IMAC5: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazole.
  • IMAC20: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole
  • IMAC20(TX): IMAC20, 0.1% TX100 IMAC200: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 200 mM Imidazole
  • これらのバッファーは精製に先立ち調製し、 4°Cで保存しておく。

詳細  *それぞれの写真をクリックすると拡大します。

    • 1.8 % agar溶液をオートクレーブにて滅菌して溶解し、45℃のWater Bathで保温しておく。
    • table.1に示す割合でbottom, top mixを作製し、45℃のwater bathで保温しておく。
    • 十分に保温したbottom mixと1.8% agar溶液を滅菌した試薬ビンまたはチューブ中で1.4 vol : 1 volの割合で2.5 ml×必要枚数分+α混和し、45℃のwater bathで保温しておく(Final 0.75% agra)。
    • 35 mmディッシュまたは6ウェルプレートにディスポのピペットを用いて2.5 mlずつ上記のbottom agarを注ぎ、4℃で8分間静置し固めた後インキュベーターにて保温する。
    • 十分に保温したとtop mixと1.8% agar溶液を滅菌した試薬ビンまたはチューブ中で4 vol : 1 volの割合で1.5 ml×必要枚数分+α混和し、45℃のwater bathで保温しておく(Final 0.36% agra)。
    • 細胞を通常の手順ではがした後、セルストレイナーを通すことでシングルセルとし、2×105cells/mlに調整する。
    • 細胞懸濁液 100 ulを 15 mlチューブに移し、ディスポのピペットを用いてtop agarを 3 ml/tube加えて泡立たないようにピペッティングし、1.5 mlずつbottom agarの上に播く。
    • 4℃で8分間静置し固めた後、インキュベーターにて保温する。
    • 1-2週間後にコロニー数をカウントするか、プレートに 5mg/ml MTT溶液を500 ul添加し、インキュベーター中で1時間程度保温することによりコロニーを染色し、カウントする(Fig.1)。

工夫とコツ

  • 溶出タンパク質を特定のフラクションにより濃度を濃く得たい場合(このプロトコルではピークは大体No.2からNo.4に来る)、カラムの出口に栓をして、溶出バッファーをビーズに加えて1-2分待って栓を開き溶出するとよい。
  • 溶出したタンパク質はかならず透析や脱塩を行ってイミダゾールを除く。イミダゾール存在下でタンパク質を凍結保存すると融解後にタンパク質が析出する 場合がある。

参考文献

  • QIAexpress Ni-NTA Fast-Start Handbook 
  • Yoshimura S, Haas AK, Barr FA. Methods Enzymol. 2008
  • 439:353-64.

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